生命早期不同时期铁缺乏对儿童运动发育影响的纵向研究

缺铁和缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是孕妇和婴幼儿人群中较常见的单一营养缺乏性疾病。许多动物研究发现铁在大脑纹状体（尾状核或壳核）、依伏神经核的聚集在时程和空间上均与多巴胺水平和受体的发育规律一致，发育早期各个不同时期在不同的大脑区域中的多巴胺受体及转运体的密度和功能与该区域的脑铁水平及脑铁需要量密切相关^［1⁃3］。对围生期缺铁仔鼠的研究证实了与多巴胺相关的活动水平、感觉运动、探索行为明显受损，其前肢抓握力、翻正反射、前肢的放置反射等发育落后于正常不缺铁仔鼠^［4-5］，在断乳补铁治疗后，成年期鼠多巴胺受体和转运体恢复正常，其感觉运动异常却仍持续存在^［6］，提示早期的缺铁可能对运动发育存在长期的负性影响。研究发现IDA婴儿的大动作、抓握和手眼协调发育均落后于无IDA的婴儿^［7］，也有少量研究发现围生期IDA 母亲所生的婴儿手眼协调和运动能力发育较差^［8⁃9］，较低的脐血铁蛋白水平可预测5岁时行为发育较差^［10］。但关于大脑运动区域依赖铁的发育关键期及纠正缺铁后或在养育环境刺激下运动功能受损是否可逆或得以追赶，均不甚清楚。本研究对儿童自婴儿 9月龄、18月龄至学龄前5岁进行纵向随访和分析，考虑生命早期不同时期缺铁及家庭教育环境两个因素，假设出生前或出生后铁缺乏都可能对儿童的运动发育有不利影响，以出生前铁缺乏的影响更加显著；家庭受教育环境有利于儿童运动发育并可能补偿缺铁对发育期大脑运动区域的损害。

一、研究对象

本研究为纵向研究，研究对象来自于 2010 年4 月至2011年12月出生于浙江省杭州市富阳区的新生儿^{［11⁃12］}。纳入标准：单胎，出生胎龄 37~41 周，出生体重 2 500~4 000 g，5 min Apgar评分≥7分；排除标准：母亲人工受孕，母亲慢性心肺、肝肾和代谢性疾病、妊娠合并症或并发症、感染（抗菌药物应用史），新生儿期或儿童期疾病如惊厥、化脓性脑膜炎、脑病或颅内出血、高胆红素血症或先天缺陷、遗传代谢性疾病。

基于脐血和9月龄血液铁营养状况测定，将研究对象分为 3组：出生前铁缺乏组：出生前铁缺乏伴或不伴9月龄时铁缺乏或IDA者；出生后铁缺乏组：出生前铁营养指标正常，9 月龄时铁缺乏或IDA 者；铁充足组：脐血和出生后各年龄点铁营养指标均正常范围。符合伦理要求，凡发现铁缺乏或IDA者，均予以铁剂补充纠正。18月龄、5岁仍有铁缺乏或 IDA 者不能纳入本研究。最终 114 名儿童（男58名、女56名）纳入，具体研究路径见图1。

研究遵循的程序符合浙江大学医学院附属儿童医院人类研究伦理委员会（批件号 2008004）及美 国 密 西 根 大 学 所 制 定 的 伦 理 学 标 准（HUM00010107）。所有研究对象均由监护人签署知情同意。

二、研究方法

1.基本资料：包括一般人口学信息、母亲孕期及儿童出生情况、性别、出生体重、出生胎龄、家庭经济收入、人口构成、父母年龄和文化程度、住房条件、是否与祖辈同住等；新生儿期通过电话访问，9 月龄、18月龄和5岁时采用面对面问卷调查形式获得资料。

2. 铁营养状况测定：取新生儿脐血及 9 月龄、18月龄、5岁时静脉血标本测定与铁营养状况相关的指标，包括血红蛋白、红细胞平均体积、红细胞容积分布宽度、血红蛋白锌原卟啉、血清铁蛋白、C反应蛋白。血常规由全血自动细胞计数仪检测（Sysmex SE⁃9000，日本）；血红蛋白锌原卟啉采用荧光分析法测定（AVIV206D 型，美国）；血清铁蛋白采用电化学发光免疫分析法（Cobas 6000⁃601，罗氏公司，瑞士）；C反应蛋白由酶联免疫吸附试验法检测（Orion Diagnostics 公司，芬兰）。

3. 判断标准：（1）出生前铁缺乏为新生儿脐血血清铁蛋白<60 μg/L 或血红蛋白锌原卟 啉 >118 μmol/mol^［13］。（2）出生后铁缺乏或 IDA 的诊断标准。铁缺乏为至少满足以下 4 项标准中的2 项，①红细胞平均体积<74 fl，② 红细胞容积分布宽度>0.145，③血清铁蛋白<12 μg/L，④血红蛋白锌原卟啉>69 μmol/mol；IDA为满足以上条件，同时伴血红蛋白<110 g/L^［14］。（3）铁充足：脐血血清铁蛋白 ≥60 μg/L，血红蛋白锌原卟啉<118 μmol/mol，血红蛋白150~175 g/L^［13］；出生后各年龄点铁营养相关指标和血红蛋白正常范围。血清铁蛋白>370 μg/L或C反应蛋白>5 mg/L，考虑铁超载或炎症可能，予以剔除。诊断为出生前铁缺乏的患儿给予元素铁1 mg/（kg·d）口服至 9 月龄，出生后诊断铁缺乏或IDA的患儿给予铁剂治疗［元素铁 2 mg/（kg·d），口服12 周］。

4. 运 动 功 能 评 估 ：9 月 龄 ，18 月 龄 时 采 用Peabody 运动发育量表评估，包括反射（12 月龄以下）、姿势、移动、物体控制（12 月龄以上）、抓握和视觉⁃运动整合6个分测试^［15］。5岁时采用BOT2⁃简版，共 12 个子项目，评估儿童精细动作、上肢协调性、身体协调性、力量与灵活度4项发育情况^［16］。以上评估均采用年龄、性别标准化后的标准分，9 月龄 Peabody 标准分为（51.21±5.64）分；18月龄Peabody标准分为（50.55±2.96）分：5岁BOT2标准分为（51.17±7.04）分，为重复测量的标准化数据，直接进行比较分析。

5. 质量控制：实施调查和评估之前对研究人员进行统一严格的培训，分组由实验室人员根据标准确定；调查和研究人员为认真负责的儿童保健、发育行为儿科医生与儿科专业研究生。调查问卷由研究人员当场核实并收回。

三、统计学分析

采用SAS 9. 2 进行统计分析。符合正态分布的定量资料用`X ± s 描述，非正态分布的定量资料用M（四分位间距）表示，定性资料用名（%）描述；研究对象一般情况的比较，正态分布的定量资料采用方差分析，非正态分布采用非参数检验，定性资料采用χ² 检验；采用多层线性模型（又称为多水平模型、混合效应模型等）进行纵向随访研究分析。分析儿童随年龄增长而发生的运动发育变化（水平1），出生前铁缺乏、出生后铁缺乏和铁充足各组间运动发育变化差异（水平2），调整变量包括父亲年龄、母亲年龄、家庭经济收入、父亲文化程度、母亲文化程度、与祖辈同住和家庭人均居住面积等混杂因素；进一步探讨不同时期铁缺乏儿童在不同母亲受教育程度下运动发展的差异，P<0.05 为差异有统计学意义。

一、一般情况及铁营养状况

共纳入新生儿 1 178 名，经脐血及 9 月龄血液铁营养状况测定，根据分组标准，114 名儿童参与运动发育评估。9月龄、18月龄、5岁各年龄组分别为 107、109 和 114 名，其中铁充足组 43 名、出生前铁缺乏组34名（仅出生前铁缺乏组15名，出生前铁缺乏和 9 月龄时铁缺乏或 IDA19 名），出生后铁缺乏组 37 名。9 月龄铁缺乏或 IDA 者经铁剂补充治疗后，18月龄、5岁时无一例铁缺乏或IDA。参与运动发育评估儿童的一般人口学资料特征与其他未参加运动发育评估的儿童差异均无统计学意义（P 均>0.05）。114 名儿童除母亲文化程度各组间存在差异外（P=0.041），其余信息变量如出生体重、出生胎龄、性别、是否与祖辈同住、父母年龄及父亲文化程度、家庭年均净收入、人均住房面积差异均无统计学意义（P均>0.05，表1）。各组儿童的脐血及 9 月龄静脉血铁营养状况见表 1，18 月龄及5 岁时的铁营养状况均提示正常。

二、不同时期铁缺乏对运动发育的影响

多层线性模型分析结果显示，在控制了父亲年龄、母亲年龄、家庭经济收入、父亲文化程度、母亲文化程度、与祖辈同住和人均居住面积等混杂因素的前提下，出生前铁缺乏组儿童平均运动评分 比 铁 充 足 组 低 2.01 分 ，差 异 有 统 计 学 意 义（52.04 比 54.05分，P=0.007）；出生后铁缺乏儿童平均运动评分（53.07分）与铁充足组差异无统计学意义（P=0.180）；各组儿童不同年龄时间点，其运动发育无明显变化趋势（P=0.751），结果见表2。

三、不同时期铁缺乏儿童在母亲不同文化程度环境的运动发育差异

进一步分析不同时期铁缺乏儿童在不同母亲文化程度环境下的运动发育情况，在母亲文化程度较高（高中及以上）组中，出生前铁缺乏儿童运动评分较铁充足组儿童低2.29分（49.86比 52.15分，P=0.031），而出生后铁缺乏组（50.57 分）与铁充足组差异无统计学意义（P=0.107）；在母亲文化程度较低（初中及以下）组，与铁充足组儿童相比，出生前铁缺乏组儿童运动评分低2.00分（49.58比51.58分，P=0.049），出生后铁缺乏组（51.13 分）与铁充足组差异无统计学意义（P=0.677）。

在铁充足组中，与母亲文化程度较低（初中及以下）的儿童相比，母亲文化程度较高（高中及以上）的儿童运动评分要高1.99分（52.45比 50.46分，P=0.036），但在出生前铁缺乏和出生后铁缺乏组，母亲文化程度高低两组差异均无统计学意义（50.70比49.06分，51.43比 50.23分，P=0.078、0.358）。

运动能力是在中枢神经系统中基底核、丘脑、大脑皮层、小脑、前庭核等多结构参与形成的复杂环路，包括髓鞘化的形成和成熟及突触结构功能完整的基础上，在后天环境刺激学习中逐步发育完善。大鼠和猴的动物实验及人类婴儿研究发现，早期铁缺乏改变脑结构（大脑髓鞘化、树突的分化和组织）、神经递质功能（多巴胺和单胺类神经递质）和神经代谢，而基底核（纹状体）和海马是大脑受累的两个主要结构。母孕期缺铁通过直接影响子鼠大脑胶质细胞增殖与分化^［17］，减少髓鞘生成，延迟髓鞘化过程^［18］；轴突神经纤维细丝的发育受损，轴突直径变小^［19］。对母孕期铁缺乏大鼠的体外培养和成年子代的神经结构研究发现，其海马、胼胝体、大脑皮层等区域的树突长度缩短，分支减少，结构混乱^{［20⁃21］}，突触密度及效能下降^［22］，以上神经结构的改变均为生命早期铁缺乏后的运动神经冲动传导受损提供了解剖学基础。基底核是锥体外系运动环路的主要结构，在广泛分布的运动网络（如黑质⁃纹状体、基底核⁃前庭核、基底核⁃运动皮层通路）中 ，成 为 连 接 其 他 多 个 脑 区 的 重 要“ 网 络 中心”^{［23⁃24］}。在这些运动环路中多巴胺能神经元是其主要神经元，多巴胺是其主要神经递质。动物研究发现母孕期或哺乳期铁缺乏的子鼠脑纹状体和伏隔核的铁浓度下降，D1、D2 受体^［3］、多巴胺转运体的密度下降^［25］，纹状体细胞外多巴胺水平增加^［2］，多巴胺的正常代谢过程被破坏^［4］，这些改变均能导致运动环路的信号传递异常。

以往生命早期铁缺乏与运动发育行为的动物实验发现，母孕期及哺乳期铁缺乏子鼠的翻正反射能力减弱^［6，18］，出生前铁缺乏的恒河幼猴活动量降低^［26］。研究发现，出生前铁缺乏或婴儿期发现铁缺乏的学龄前儿童仍存在运动能力的落后^{［10，27］}，但运动环路依赖铁的发育关键期及是否经铁剂补充纠正缺铁后能追赶至正常均不甚明了。本研究发现出生前铁缺乏（包括出生前及出生后9月龄仍有铁缺乏）儿童的运动能力不能随年龄发展而追赶上铁充足儿童，而出生后铁缺乏儿童的运动发育能随年龄而追赶，与铁充足儿童差异无统计学意义，提示出生前可能是运动系统依赖铁发育的关键期，尤其是出生前延续至出生后早期的慢性铁缺乏，使其出生前的受损不能及时得到恢复。

环境刺激和早期学习是运动功能发育成熟的另一重要因素。啮齿类动物基因敲除或药物注射破坏新生鼠少突胶质细胞或多巴胺能神经末梢的研究发现，运动训练或提供更加丰富的养育环境能使新髓鞘生成、突触数量增加并修剪，效能加强，多巴胺释放增加，从而提高运动能力^{［28⁃31］}。健康婴幼儿及学龄期儿童的研究发现，母亲文化程度高或家庭收入高均对儿童运动能力发育有着积极作用^{［32⁃34］}，提示较好的家庭养育环境可能为儿童提供了丰富的刺激和学习机会，有助大脑新髓鞘生成、突触修剪和网络建立，从而使原有的损伤获得补偿，使潜能获得充分发挥。本研究发现，母亲受教育程度较高可使铁充足儿童的运动潜能得到充分发挥，但并不能完全补偿出生前铁缺乏对大脑运动区域发育的损伤；虽能使出生前铁缺乏儿童的运动发育有所追赶，但仍未能赶上同等家庭受教育环境的铁充足儿童，提示预防孕期缺铁对儿童早期发展的重要性。

本研究也存在一定的局限，由于研究样本量的限制，出生前铁缺乏不能与出生前及9月龄铁缺乏或IDA分组，因此仍较难鉴别出生前铁缺乏与铁缺乏持续时间对大脑发育的损伤，需进一步扩大样本量，并继续追踪了解不同时期铁缺乏与养育环境对运动和认知发育的远期交互影响作用。

利益冲突 研究对象的铁补充剂（蛋白琥珀酸铁口服溶液）来自李氏大药厂（香港）有限公司的捐赠

志谢 杭州市富阳区妇幼保健院的支持